臺式離心機進行腎單層細(xì)胞培養(yǎng)的操作過程
發(fā)布時間：2015-7-8 10:36:38??????點擊：
組織培養(yǎng)的方法很多，大體分為懸浮培養(yǎng)和固定培養(yǎng)兩類。懸浮培養(yǎng)是將切碎的組織塊通過臺式離心機進行離心分離，然后將通過臺式離心機分離出來的分散的細(xì)胞放在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中，讓其浮游于液體小進行培養(yǎng)，然后接種病毒。
另外還有固定培養(yǎng)法是使組織塊通過臺式離心機分散的細(xì)胞粘附與容器壁上進行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長良好后接種病毒。病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖的主要標(biāo)志是細(xì)胞病變(壞死、崩解、脫落等)，細(xì)胞融合或形成包涵體，對紅細(xì)胞的吸附作用等。
下面簡單介紹通過臺式離心機進行“腎單層細(xì)胞培養(yǎng)”的一般操作技術(shù)。
1．取腎：用無菌操作取出斷乳前后幼齡動物的腎臟置滅菌平皿中，剪去留的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎盂及髓質(zhì)部分，用含雙抗(指青、鏈霉素，下同)的漢克氏液洗凈，移置小燒杯中，剪成乳糜狀，再用漢克氏液洗2—3次，至液體澄清無血細(xì)胞為止。
2．消化；加入10倍的0.125％胰酶液進行消化。有熱消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)兩種。消化的時間根據(jù)不同的組織細(xì)胞和所用胰酶的活性而定，直至聚成絮狀的腎組織又分散開。取出傾去胰酶，用漢克氏液洗滌數(shù)次，然后加入少量乳漢液，用吸管進行吹打(即吸入和吹出)10-20次，使組織分散為細(xì)胞。將分散的細(xì)胞經(jīng)2—3層消毒紗布過濾，取濾液置于臺式離心機中以1500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，棄去上清液，加適昆乳漢液混勻，再次通過臺式離心機離心，最后加入乳漢液使細(xì)胞懸浮其中，收集于滅菌三角瓶中。
3．細(xì)胞計數(shù)和分裝：取已制好的細(xì)胞懸浮液，用計數(shù)白細(xì)胞的方法計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，用營養(yǎng)液(pH6.8—7.0)稀釋為每毫升含50-60萬細(xì)胞，分裝于小扁瓶中(容量約50毫升的扁瓶加懸液約5毫升)，也可分裝在鏈霉素小瓶中。
4．培養(yǎng)：在37℃培養(yǎng)，3—4天即可粘附瓶壁形成單層細(xì)胞，以后每過3—4大更換一次維持液。
5．接毒；將病料剪碎，按1：4加含雙抗的漢克氏液研磨成乳糜狀，經(jīng)凍融處理使細(xì)胞破碎，病毒充分釋放，用臺式離心機，將轉(zhuǎn)速控制在3000轉(zhuǎn)/分左右離心15分鐘，將上清液接種到已生長單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，在37℃溫箱中吸附30-60分鐘，然后加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)。
6．收獲病毒：每日或隔日用低倍顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)有50-75％細(xì)胞出現(xiàn)病變隊時可收集培養(yǎng)瓶中液體，從放在冰箱(-20℃)中保存，此即繁殖的病毒液。
7．注意事項：培養(yǎng)皿及其他使用器具的潔凈、臺式離心機的使用、水的質(zhì)量、酸堿度、無菌操作等，都是關(guān)系到組織培養(yǎng)成敗的重要問題，必須嚴(yán)格規(guī)定的要求去做。
另外還有固定培養(yǎng)法是使組織塊通過臺式離心機分散的細(xì)胞粘附與容器壁上進行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長良好后接種病毒。病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖的主要標(biāo)志是細(xì)胞病變(壞死、崩解、脫落等)，細(xì)胞融合或形成包涵體，對紅細(xì)胞的吸附作用等。
下面簡單介紹通過臺式離心機進行“腎單層細(xì)胞培養(yǎng)”的一般操作技術(shù)。
1．取腎：用無菌操作取出斷乳前后幼齡動物的腎臟置滅菌平皿中，剪去留的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎盂及髓質(zhì)部分，用含雙抗(指青、鏈霉素，下同)的漢克氏液洗凈，移置小燒杯中，剪成乳糜狀，再用漢克氏液洗2—3次，至液體澄清無血細(xì)胞為止。
2．消化；加入10倍的0.125％胰酶液進行消化。有熱消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)兩種。消化的時間根據(jù)不同的組織細(xì)胞和所用胰酶的活性而定，直至聚成絮狀的腎組織又分散開。取出傾去胰酶，用漢克氏液洗滌數(shù)次，然后加入少量乳漢液，用吸管進行吹打(即吸入和吹出)10-20次，使組織分散為細(xì)胞。將分散的細(xì)胞經(jīng)2—3層消毒紗布過濾，取濾液置于臺式離心機中以1500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，棄去上清液，加適昆乳漢液混勻，再次通過臺式離心機離心，最后加入乳漢液使細(xì)胞懸浮其中，收集于滅菌三角瓶中。
3．細(xì)胞計數(shù)和分裝：取已制好的細(xì)胞懸浮液，用計數(shù)白細(xì)胞的方法計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，用營養(yǎng)液(pH6.8—7.0)稀釋為每毫升含50-60萬細(xì)胞，分裝于小扁瓶中(容量約50毫升的扁瓶加懸液約5毫升)，也可分裝在鏈霉素小瓶中。
4．培養(yǎng)：在37℃培養(yǎng)，3—4天即可粘附瓶壁形成單層細(xì)胞，以后每過3—4大更換一次維持液。
5．接毒；將病料剪碎，按1：4加含雙抗的漢克氏液研磨成乳糜狀，經(jīng)凍融處理使細(xì)胞破碎，病毒充分釋放，用臺式離心機，將轉(zhuǎn)速控制在3000轉(zhuǎn)/分左右離心15分鐘，將上清液接種到已生長單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，在37℃溫箱中吸附30-60分鐘，然后加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)。
6．收獲病毒：每日或隔日用低倍顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)有50-75％細(xì)胞出現(xiàn)病變隊時可收集培養(yǎng)瓶中液體，從放在冰箱(-20℃)中保存，此即繁殖的病毒液。
7．注意事項：培養(yǎng)皿及其他使用器具的潔凈、臺式離心機的使用、水的質(zhì)量、酸堿度、無菌操作等，都是關(guān)系到組織培養(yǎng)成敗的重要問題，必須嚴(yán)格規(guī)定的要求去做。
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